تحسين أجهزة PCR المريحة في الوقت الحقيقي

إذا كان PCR الكمي مضان في الوقت الحقيقي لتقدير كمية الفيروس والتنميط الجيني SNP، فنحن بحاجة إلى جهاز PCR بأعلى خصوصية ممكنة؛إذا كان الكشف عن مسببات الأمراض وmRNA، فإننا بحاجة إلى حساسية عالية جهاز بي سي آرفكيف ينبغي علينا تحسين جهاز PCR هذا؟

وهنا قائمة المحتوى:

ل تحسين كفاءة تضخيم آلة PCR

ل استخدام الاشعال آلة PCR في الوقت الحقيقي لPCR العام

تحسين كفاءة تضخيم آلة PCR

لتحسين آلة PCR كفاءة التضخيم، والنوعية، والحساسية، يمكننا تحسين آلة PCR الكمية مضان في الوقت الحقيقي للتجربة من خلال سلسلة من التدابير.الأول هو اختيار التسلسل المستهدف.

1، اختيار تسلسل هدف جهاز PCR مناسب في الوقت الحقيقي بطول مناسب يتراوح بين 50 إلى 150 نقطة أساس.تستغرق التسلسلات الأقصر وقتًا أقل للتوليف ولها أوقات تضخيم أقصر، وبالتالي تقل احتمالية تلويث الحمض النووي الذي يتم تضخيمه.

2، عند اختيار التسلسل المستهدف، استخدم البحث بلاست لتحليل التسلسل المستهدف لتعدد الأشكال وأخطاء التسلسل وتجنبها.إذا كانت هناك تسلسلات مكررة في التسلسل المستهدف، فسوف يقلل ذلك من حساسية الكشف لجهاز PCR ويجب أيضًا تجنبه.

3، التحكم في محتوى GC ≥ 60% في التسلسل المستهدف.سيؤثر المحتوى العالي من GC على تمسخ التسلسل المستهدف في الدورة الحرارية، ولكن من السهل أيضًا إنتاج تضخيم غير محدد لآلة PCR.

4، تجنب توليد البنية الثانوية.من السهل إنتاج تسلسلات الهدف ذات التسلسلات المتكررة العكسية بنية ثانوية، مما يؤثر على تهجين أجهزة الاشعال والتحقيقات المريحة لآلة PCR في الوقت الحقيقي.

بالإضافة إلى ذلك، نحتاج أيضًا إلى التأكد من أن جودة القالب لن تؤثر على التضخيم، وأن نتائج جهاز PCR المناسب في الوقت الحقيقي تتمتع بالموثوقية.على سبيل المثال، لا يمكن تضخيم الحمض النووي التالف بشكل كافٍ في جهاز PCR، أو لا يتم تضخيمه على الإطلاق.أيضًا، يمكن أن يؤثر وجود كواشف تثبيط بوليميراز الحمض النووي (DMSO، وما إلى ذلك) والملوثات (SDS، وما إلى ذلك) في القالب على موثوقية نتائج تضخيم جهاز PCR.

استخدام بادئات جهاز PCR في الوقت الحقيقي لـ PCR العام

احصل على الوقت الحقيقي المناسب جهاز بي سي آر الاشعال، ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لPCR العادي.

1، يجب أن يكون الطول 18-30 نقطة أساس لضمان خصوصية الربط.

2، يجب أن تكون درجة حرارة الانصهار (قيمة Tm) 55-60 درجة مئوية، ويجب أن تختلف قيم Tm للبادئين بمقدار 2-3 درجة مئوية.

3، يجب أن يحتوي كل جهاز تمهيدي على 1 إلى 3 جوانين أو سيتوزينات في نهاية 3'، مما يمكن أن يقلل بسهولة من التضخيم غير المحدد أثناء جهاز PCR في الوقت الفعلي.أكثر من 3 سيؤدي إلى نتائج عكسية ويتسبب في 'تأثير انزلاقي' يؤدي إلى الامتداد الخاطئ.

4. يجب أن يكون محتوى GC في البادئات حوالي 50%، وسيؤدي محتوى GC المرتفع جدًا إلى زيادة قيمة Tm.

5، يجب أن تتجنب بادئات جهاز PCR التسلسلات المتكررة العكسية، لأنها ستشكل بنية ثانوية، مما يؤثر على الارتباط التمهيدي في القالب.

6، إذا كان RT-PCR، فأنت بحاجة أيضًا إلى تجنب تصميم الاشعال لربط تسلسلات إكسون، مما سيؤدي إلى نتائج تجريبية إيجابية كاذبة لآلة PCR.ينبغي تصميم النهج الصحيح على جناح الإنترون الطويل، أو الإنترونات القصيرة، أو عبر منطقة تقاطع إكسون-إكسون.

7. تحلية وتنقية البادئات.

لاحظ أنه في بعض الأحيان، بعد الانتهاء من جميع النقاط، قد لا يتم تضخيم البادئات، لذا يجب عليك إعادة تصميم البادئات.

من خلال التركيز على الكشف السريع عن الحمض النووي والكشف السريع في نقطة الرعاية، تقدم Bioteke أنواعًا من الأدوات المعملية مثل: جمع عينات الفيروسات، ومستخرج الحمض النووي التلقائي، وجهاز PCR، وأجهزة التطهير.كما أنها توفر أنواعًا كثيرة من الكواشف والأطقم.